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    生物藥研發與生產:高技術壁壘,成本與質量控制核心

    2018-06-06  wbsh1982

        生物藥研發生產主要包括藥物發現、臨床前研究、臨床試驗和商業化生產等階段。從藥物發現開始,到臨床研究申請(IND)前,大概需要3-6 年,期間要完成臨床前研究,包括工藝開發、技術轉移和制造生產三個步驟。IND 審核批準通過后,可以進行臨床試驗,臨床試驗一般至少需要進行I、II、III 三期,這個階段需要6-7 年,在臨床試驗成功后可向FDA提交生物制品上市許可申請(BLA)。FDA 受理申請文件后,需要進行生物制品上市許可申請批準前檢查(PAI),審核通過后,藥品可以開始生產上市,這一階段大概需要0.5-2 年。生物藥研發整個流程下來平均需要消耗9.5-15 年的時間,其時間成本、人力物力的投入都是巨大的。

    圖1:生物藥研發時間及商業化成本

    1、 壁壘1:發現與制備,轉基因小鼠平臺Vs 噬菌體展示技術


    以目前最為火熱的抗體藥為例,目前人源抗體的制備主要包括兩項技術:轉基因小鼠技術和噬菌體展示技術。

    ? 轉基因小鼠平臺:具有高特異性、高親和力等特點,能大大減少潛在的免疫源性,但是其研發投入大、周期長,也帶來一定的局限性。

    ? 噬菌體展示技術:具有快捷、準確、不受氨基酸位點限制、庫容量大等特點,能夠模擬天然表位的結構和功能,免疫源性好,生產成本相對低廉,但是該技術仍存在一定的不足之處,容易受到密碼子表達偏好性、轉化效率、陽性克隆等影響。

    圖2:轉基因小鼠平臺與噬菌體展示技術的比較

    1.1人源化轉基因小鼠平臺

    隨著單克隆抗體雜交瘤技術的建立,人們在鼠源抗體的基礎上逐漸開發出了更具人源親和性的全人源抗體,轉基因小鼠就是生產全人源抗體的一個重要平臺。截至2015 年12 月底,FDA 已批準上市12 種通過轉基因小鼠平臺技術開發的全人源單抗,如安進的evolocumab(antiPCSK9)、nivolumab(anti-PD-1)和denosumab(anti-RANKL)等,以及常用靶點升級抗體藥物panitumumab(anti-EGFR)、canakinumab(anti-IL-1β)和ofatumumab

    (anti-CD20)等。轉基因小鼠在人源抗體藥物的研發上具有自身優勢,轉入小鼠的人免疫球蛋白基因在小鼠的免疫系統中可進行天然抗體的選擇機制和成熟機制,使得產生的抗體具備成為藥物的天然優勢。轉基因小鼠平臺可通過雜交瘤制備全人源單抗,用于前期的藥物研究。目前主要有三大轉基因小鼠平臺:

    ? Medarex 公司的HuMAb-Mouse:目前已被授權給多家藥企使用,從而利用該技術完成了眾多靶點的全人源單抗研發。

    ? Abgenix 公司的XenoMouse:2005 年,XenoMouse 技術被Amgen 公司花費22億美元從Abgenix 公司收購,利用這一平臺生產的產品包括Vectibix 等。

    ? Regeneron 公司的Veloclmmune mouse:新一代的轉基因小鼠技術平臺,該平臺不再僅僅可以產生完整的全人源單抗,還可以產生多樣化、高質量、特異性強的全人源單抗可變區,這些可變區的編碼DNA 可與任何給定的人源恒定區序列進行連接,從而按照預想的方向設計抗體分子,代表產品包括Dupixent 等。

    ? 另外還有日本協和發酵麒麟的TC Mouse 和KM Mouse,以及Open MonoclonalTechnology(OMT)的OmniMouse,該平臺已被藥明生物和金斯瑞科技采用。

    圖3:轉基因小鼠平臺下單克隆抗體制備流程






              

    1.2 噬菌體展示技術

    噬菌體展示技術是制備人源抗體、小分子抗體和其它各類抗體的另一重要平臺,這一技術是應用最廣泛的體外抗體篩選技術。產品包括英國Cambridge Antibody Technology 公司(現屬于AstraZeneca 公司)的Adalimumab 等。Adalimumab 后被艾伯維公司的購得,商品名為Humira (修美樂),2016 年其銷售額高達161 億美元。

    該技術的基本原理是采用生物學手段,在噬菌體基因組中插入抗體基因片段,使噬菌體外殼蛋白表面能夠融合表達抗體片段,實現了抗體基因型和表現型的統一,即可用于篩選,也可再次感染宿主菌進行擴增。其中每個噬菌體展示一種抗體,這些重組噬菌體的集合稱作噬菌體抗體庫,可以方便的用來抗體高通量篩選。從人B 淋巴細胞中擴增抗體基因,可用來構建人源噬菌體抗體庫用于抗體篩選。

    噬菌體展示技術能夠克服免疫耐受,在制備靶向腫瘤、自身抗原、毒性抗原、高度保守的抗原等抗體中具有很大的優勢,同時也可采用細胞、組織作為抗原甚至在生物體內篩選抗體,應用廣泛,并且篩選效率高。

    圖4:噬菌體展示技術流程圖

         

    2、 壁壘2:生物藥的表達基礎——細胞株的構建

    目前,體外重組蛋白的生產主要包括兩大系統:原核細胞蛋白表達和真核細胞蛋白表達。不同的表達系統所生產的蛋白在活性和應用方法方面均有所不同。

    圖5:不同表達系統的優缺點對比

    2.1 原核細胞表達系統

    原核表達系統主要包括大腸桿菌表達系統、乳酸球菌表達系統、芽孢桿菌表達系統這三類。但是原核表達系統的最大問題在于外源蛋白轉錄后缺乏糖基化和磷酸化修飾,并且原核表達的蛋白無法形成復雜二硫鍵。當然原核表達也有很多優點:

    ? 大腸桿菌:屬于革蘭氏陰性菌,遺傳背景清晰,繁殖速度快,成本低且表達量高。多用于目標蛋白分子量小于100kD,且翻譯后修飾作用不影響特定結構和生物活性的蛋白表達。大腸桿菌是目前最常用的原核表達系統,市場上銷售的大約30%的重組蛋白產品由大腸桿菌生產,例如部分胰島素和人生長激素。全球胰島素市場在2014 年的規模就已經達到了140 億美元,預計我國2020 年的胰島素市場可達到760 億元。代表產品如法國禮來公司(Eli Lilly and Company)的優泌林(Humulin),2017 年上半年銷售額6.72 億美元。

    ? 乳酸菌:屬于革蘭氏陽性菌,膜單一,主要用于大量膜蛋白的表達。

    ? 芽孢桿菌:屬于革蘭氏陽性菌,它能表達并分泌外源蛋白到培養基中,適合分泌型蛋白的生產,如細胞因子或需要形成復雜二硫鍵的外源蛋白。利用芽孢桿菌表達的外源蛋白包括白細胞介素、人表皮生長因子(hEGF)、胰島素原等。

    圖6:原核表達系統及其代表產品

    2.2 真核細胞表達系統

    真核細胞表達系統主要包括酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統、哺乳動物細胞表達系統這三類,此節重點介紹前兩類,哺乳動物細胞表達系統在下面的章節詳細介紹。

    ? 酵母表達系統:酵母中表達的外源蛋白可以進行翻譯后修飾,如磷酸化和糖基化。用于外源蛋白表達的酵母菌株包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、畢赤酵母和乳酸克魯維酵母。釀酒酵母生產的重組蛋白包括人胰島素、胰高血糖素、水蛭素類似物、尿酸氧化酶、血小板衍生生長因子等。代表產品如諾和諾德公司生產的諾和靈(胰島素)系列產品。

    ? 昆蟲細胞表達系統:可以實現膜蛋白和蛋白激酶的表達。在大多數昆蟲細胞表達系統中,外源基因通過桿狀病毒載體轉染宿主細胞,從而將目標基因通過同源重組插入到宿主的基因組中。昆蟲細胞來源的獲批藥物包括:葛蘭素史克的宮頸癌疫苗Cervarix、Valeant 的前列腺癌治療疫苗Provenge 和Protein Science 的流感疫苗Flublok 等。

    圖7:酵母和昆蟲細胞表達系統及其代表產品

    2.3 哺乳動物細胞表達系統

    目前,哺乳動物細胞表達已成為生物藥生產特別是抗體藥生產最重要的技術。與酵母等其它真核細胞系相比,哺乳動物細胞表達外源蛋白的優勢在于可表達含有復雜二硫鍵或翻譯后修飾的靶蛋白,且蛋白可分泌到培養液中,其產物蛋白的糖基化程度高且均一,有效提高藥效,同時減少藥物副作用。

    中國倉鼠卵巢細胞(CHO)細胞是目前重組蛋白生產領域最具代表性的工程細胞,其具有高效擴增和表達的特點,在補料培養中可達到1-10g/L。據統計,使用CHO 細胞系作為表達載體開發的抗體藥物超過60%。CHO 細胞從1957 年被首次分離,目前已馴化出多種商業化細胞系,包括CHO-K1、CHO-S 等。

    ? CHO-K1SV 細胞:為龍沙訓化的第一代的CHO-K1 細胞系,應用最廣泛,已有29種該系統生產的藥物獲批上市,如羅氏的Zenapax、Medlmmune 的Synagis 等;

    ? CHO-S 細胞是通過馴化篩選生長速度快的CHO 細胞得到的,商品化細胞系以賽默飛世爾的CHO-S 為代表。

    ? 目前,越來越多的工程改造細胞系被用于提高藥物的質量和產率,如使用ZFNs、TALEN、CRISPR 等基因組編輯技術對CHO 細胞系的基因進行改造。

    其它主要哺乳動物細胞系包括HEK293(人胚腎細胞)、HT-1080(人纖維肉瘤細胞)、BHK(乳倉鼠腎細胞)細胞系。

    ? HT-1080 細胞: Agalsidase alfa, Epoetin delta (DYNEPO), Idursulfase

    (ELAPRASE) 和Velaglucerase alfa (VPRIV)等。

    ? HEK293 細胞:百健開發的長效八因子Eloctate、長效九因子Alprolix 以及Octapharma 開發的八因子產品Nuwiq 和禮來的GLP-1 產品Trulicity(

    度拉魯肽)。

    ? BHK 細胞:常用來表達疫苗產品,用此細胞系表達的上市糖蛋白藥物還包括諾和諾德的七因子NovoSeven、拜耳的八因子Kogenate 和百特的豬八因子Obizur。

    圖8:哺乳動物細胞表達系統及其代表產品

    3、 壁壘3:生物藥的生產


    生物制品生產工藝的開發過程一般需要經歷工程細胞庫的構建、搖瓶工藝開發、小試工藝開發、中試放大、生產純化和制劑等步驟。細胞庫通常是三級管理,即原始細胞庫(PCB)、主細胞庫(MCB)和工作細胞庫,其中MCB 和WCB 需要檢定合格后并分別于GMP 環境下存放。

    另外,根據生物制劑的屬性特點不同,會采用不同的哺乳動物細胞進行生產,其中BHK21、CHO 細胞等傳代細胞系已證明具有致瘤性,可不必做致瘤性檢測;而Vero 細胞因其在一定代次內無致瘤性,則必須做致瘤性檢測。

    圖9:生物制品生產工藝開發流程示意圖

    圖10:生物制劑生產工藝詳細流程

    圖11:細胞株的構建

    生物藥的生產工藝主要包括流加式培養和連續式培養


    ? 流加式培養

    流加式培養(fed-batch,又稱為“補料分批培養”)在過去的幾十年里,是生物制藥行業進行細胞培養制備生物藥最常用的方式。該方法在實現高表達方面取得了巨大的進步,形成了一整套完整的工藝開發和生產體系,其因操作相對簡單,易于監控和產品檢測和放行等特點,絕大多數企業均采用fed-batch 作為其藥品生產的操作方式。

    流加培養是當前重組蛋白生產的主流培養模式。流加式操作主要是根據細胞對營養物質的不斷消耗和需求,連續或半連續的流加濃縮營養物,使細胞持續高密度的生長,提高單位反應器體積內目的蛋白產量,從而達到高效生產的目的。流加培養工藝的關鍵技術主要包括細胞代謝的調控、培養基的優化設計、流加策略的選擇及優化。

    目前國際上主流抗體藥物的生產工藝為流加培養,建造規模已達萬升級。流加培養工藝操作相對簡便,可重復性強,較連續灌注模式減少了較多的操作環節,降低了污染的機會,有利于產品批次間的穩定性和過程成本的控制。但流加培養模式最大的缺點是產能受限于發酵罐的尺寸,為了提高產能只有建造更大的發酵罐。

    ? 連續式/灌注式細胞培養

    除了傳統的流加式培養,現在有些公司開發了另一種連續流工藝培養模式,也稱灌流培養模式。灌流式培養是把細胞和培養基一起加入反應器后,在細胞增長和產物形成過程中,不斷地將部分培養基取出,同時又連續不斷地灌注新的培養基。在灌注培養中,細胞保留在反應器系統中,收獲培養液的同時不斷地加入新鮮的培養基。

    灌注培養的主要優點是使用更小的設備表達更多產物和有效改善產品質量,同時補料營養成分連續加入,有害代謝產物得以及時去除,細胞在生長過程中能夠長時間維持高密度培養和存活率,表達產物具備高度一致性。當反應體系內表達的是易降解或者半衰期很短的產品時,灌注的優勢尤為明顯。培養環境的優化、體系的精確穩定控制、細胞培養基的開發以及微膜過濾細胞截留設備的發展也進一步推動了連續灌注工藝的發展。缺點是產物稀釋與收獲液體積大。

    目前已經有多個使用灌流工藝進行培養的上市產品,如凝血因子(FVIII 產品:Kogenate,拜耳;Refacto,輝瑞;FVII 產品:Novoseven,諾和諾德),Protein C(Xigris,禮來)及其他的酶制劑甚至包括一些單抗產品(Reopro 和Remicade,強生;Simulect,諾華)。

    圖12:流加式細胞培養和連續式/灌注式細胞培養工藝

    連續灌注培養又分為濃縮分批補料和灌注培養兩種方式,其主要區別在于截留設備截留的分子量大小。濃縮分批補料的主要目的是在相對短的時間內,通過高細胞密度和活率的維持實現產物高表達,通常用于表達單抗等穩定蛋白的產品,因為它們不會隨著培養時間的增加(20-30 天)而出現降解等產品質量方面的問題。對于灌注生產而言,目標蛋白會持續通過截留設備流出到反應體系之外,因此可以保證蛋白持續收獲純化,通常用于表達不穩定的融合蛋白和細胞因子等產品。

    圖13:濃縮分批補料和連續灌注培養對比





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